Struttura, catalisi, trasporto della chitina e inibizione selettiva della chitina sintasi

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4776 (2023) Citare questo articolo

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La chitina è uno dei biopolimeri naturali più abbondanti e funge da componente strutturale critico delle matrici extracellulari, comprese le pareti cellulari dei funghi e gli esoscheletri degli insetti. Essendo un polimero lineare della N-acetilglucosamina legata a β-(1,4), la chitina è sintetizzata dalla chitina sintasi, che è riconosciuta come bersaglio per farmaci antifungini e anti-insetti. In questo studio, determiniamo sette diverse strutture al microscopio crioelettronico di una chitina sintasi di Saccharomyces cerevisiae in assenza e presenza di glicosil donatore, accettore, prodotto o inibitori del nucleoside peptidlico. Combinate con le analisi funzionali, queste strutture mostrano come i substrati donatore e accettore si legano nel sito attivo, come l'idrolisi del substrato guida l'autoadescamento, come si apre un canale transmembrana che conduce la chitina e come gli inibitori del nucleoside peptidlico inibiscono la chitina sintasi. Il nostro lavoro fornisce una base strutturale per comprendere la funzione e l'inibizione della chitina sintasi.

La chitina è il secondo polisaccaride naturale più abbondante sulla terra dopo la cellulosa e ogni anno gli organismi viventi producono circa 100 miliardi di tonnellate di chitina1. La chitina è un componente primario delle pareti cellulari dei funghi, degli esoscheletri di crostacei e insetti, e svolge un ruolo essenziale nella riproduzione, crescita o sviluppo di questi organismi2. La chitina è un polimero a catena lunga di N-acetilglucosamina (GlcNAc) legata a β-(1,4) ed è sintetizzata dalla chitina sintasi nella membrana plasmatica3,4. La chitina sintasi catalizza la formazione di legami glicosidici β (1 → 4) nella chitina utilizzando GlcNAc attivato da UDP (UDP-GlcNAc) come donatore di zucchero e nel frattempo trasporta il prodotto polisaccaridico attraverso la membrana (Fig. 1a).

uno schema di sintesi e trasporto della chitina da parte di Chs1. b Test in vitro della glicosiltransferasi UDP-Glo ​​con Chs1 purificato in tampone con (WT) o senza (noGlcNAc) GlcNAc. Il test in condizioni WT è stato eseguito anche con EDTA, trypsin, NikkoZ o PolyB. La reazione senza Chs1 è stata utilizzata come controllo. I punti dati rappresentano la media ± DS in triplicato. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine. c Test di sintesi della chitina in vitro con Chs1 purificato in tampone con (WT) o senza (noGlcNAc) GlcNAc. Il test in condizioni WT è stato eseguito anche con EDTA e trypsin. La reazione senza Chs1 è stata utilizzata come controllo. I punti dati rappresentano la media ± DS in triplicato. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine. d Mappa Cryo-EM e modello atomico del dimero apo Chs1. e Rappresentazione cartoon del monomero Chs1. Il polipeptide è mostrato in arcobaleno dal terminale N al C-terminale. Il presunto sito attivo è evidenziato da un cerchio arancione. Il presunto canale di trasporto della chitina è delineato da una freccia viola. f Topologia dei cartoni animati del monomero Chs1. g La mappa del dominio Chs1. I principali domini e motivi sono etichettati. La regione N-terminale invisibile è in bianco.

In Saccharomyces cerevisiae, la chitina sintasi è codificata principalmente da CHS1, CHS2 o CHS3. L'eliminazione simultanea di tutti e tre i geni è letale nel lievito5. ScChs1 e ScChs2 appartengono alla stessa famiglia della chitina sintasi, che contiene un numero diverso di eliche transmembrana da ScChs36. ScChs1 e ScChs2 sono responsabili della sintesi del setto primario e sono legati alla separazione cellulare nella citocinesi, mentre ScChs3 è responsabile della formazione di chitina nell'anello gemma e di chitina dispersa nella parete cellulare5,7,8,9,10,11. Studi precedenti hanno indicato che Chs1 è principalmente in forma zimogena e può essere attivato mediante proteolisi3,12,13.

La chitina sintasi appartiene alla famiglia delle glicosiltransferasi 2 contenenti la piega GT-A, che comprende anche l'acido ialuronico e la cellulosa sintasi14,15. Negli ultimi anni sono state riportate le strutture dell'acido ialuronico e della cellulosa sintasi, fornendo informazioni strutturali sui loro meccanismi di funzionamento16,17,18,19,20,21. Tuttavia, la struttura della chitina sintasi non è stata determinata, ostacolando una comprensione meccanicistica dei meccanismi catalitici e di trasporto della chitina sintasi.